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CO-IP技术交流
发布时间:2019-01-20 12:00:00来源:深圳市第二人民医院 分享:

  预备物品  

  转子,冰,预冷4度离心机,PBS,WCE buffer; protein A/G;

  1,细胞裂解

  a:根据目的蛋白的丰度估计所需细胞量,并根据实验目的施加各 种处理因素(如,转染等)或制备亚细

  胞组分。

  b:去除培养基,若有很多皿,将待处理皿放在冰上

  c:用适量预冷洗一遍,以去除残留培养基,最后吸尽培养基

  d:加RIPA,12-well dish per well/250uL; on-ice 5-10min (晃动平皿,使裂解液均匀覆盖,利于细胞裂解)

  e:用刮匙刮,并收集细胞裂解液至1.5mL EP管。

  2,裂解液处理

  a: 加入proteinase inhibitor和PMSF

  b: 离心,12000g 10min

  c: 保留上清,BSA法测蛋白浓度(接着做IP或放-40度保存)

  3,抗体结合

  a:取出细胞lysate,用WCE稀释至蛋白浓度为2mg/mL,蛋白总量根据目的蛋白丰度决定(大概1mg-2mg)。留

  取少许样品作为后续WB的input

  b:补充proteinase inhibitor及PMSF等

  c: 离心,10000g 10min

  d: 取上清, 加入目的蛋白抗体(依据说明书和经验判断抗体的使用量)

  e: 冷库,旋转,3H 或者过夜

  4,protein A/G

  a: 取20uL beads per sample。根据前述抗体种类选择Protein A或G。

  b: 加入600uL WCE混匀,室温静置5min,瞬时离心20sec,去除上清保留beads

  c: 加WCE至100uL,混匀,平分至样品中

  d: 冷库转动2H

  5,wash

  a: On-Ice 5min, 瞬时离心20sec,去除上清(留取少许样品标记为flowthrough,上清也可保留,以备万一IP

  失败重复使用)

  b: 加入800uLWCE,重复以上a step 3次

  c: 最后一步小心去尽上清,根据后续目的处理(若研究目的为蛋白结合RNA,则加trizol提取RNA;若为研究结合蛋白,则可直接加30 ul 2XSDS sample buffer)