您现在的位置:首页 > 科室简介 > 科研平台及其他 > 中心实验室
Southern Blotting 技术交流
发布时间:2019-01-20 12:00:00来源:深圳市第二人民医院 分享:

  酶切及转膜: 

  1. DNA digestion:  

  10ug Genomic DNA digested with corresponding enzyme, 24hrs. 

  Tips: 消化反应要进行完全。高分子量的DNA消化所遇到的主要问题是:由局部DNA浓度的差异引起的消化不均匀。相对而言,限制酶不易进入DNA团块中,只能从团块外部进行消化。因此,要保证DNA在消化体系中分布均匀。如果可能,采用较大的反应体积。在加入限制酶之前,稀释DNA 并加入限制酶的Buffer,置于4℃数小时,使基因组DNA分散。加入第一份限制酶5Units/ug DNA,小心混匀,在37℃反应15min-30min后,加入第二份限制酶5U/ug DNA,在37℃反应12-24小时。在操作过程中,使用的Tips必须剪掉尖端,轻缓慢吸取,以防止基因组DNA断裂。 如果基因组定量不准,可以切15-20ug,消化完毕用EtOH沉淀再定量。上样时每孔上10ug切好的DNA,此时必须定量准确。 

  2. EtOH precipitate digestion product if necessary。 

  Tips: 先在酶切反应体系中加入1/10 体积的NaAC(3M,pH5.2) ,混匀。再加入2 倍体积的EtOH,混匀后放至-80℃冰箱30min,以保证充分沉淀。4℃,14000g离心15min, 小心吸去上清,加入500ul 70%EtOH,14000g离心5min,小心吸去上清。将离心管盖打开,室温干燥10min,加入20-30ul TE溶解。将离心管盖打开,置于55-60℃干燥箱10min,可以将残留的EtOH挥发干净。 

  3. Electrophoresis: 0.7~1% gel (argarose II), 50v, 5hrs 

  Tips:选择strength>1500 的Agrose 制胶,这样在后期操作中,胶不易损坏。将样品延胶孔的侧壁缓缓加入,加完后先静置2-3min,让样品在胶孔内扩散均匀,然后再加电压,开始电泳。可用30-40V 低压电泳过夜。TAE Buffer 必须要漫过加样孔上方,否则由于表面张力的作用,加入的样品会跑到加样孔外。在电泳结束之前,可以在加样孔内加入一定量的Loading buffer,作为脱嘌呤时的颜色标记 

  4.紫外灯下检查电泳结果,割取周围多余的胶。 

  Tips:用刀片将Marker所在的条带处将胶切穿,作为后续操作的标记。为了方便操作,可以在转膜之前再切去周围多余的胶。 

  5.0.25M HCl VS-50 Rocker 摇10min,溴酚蓝会变成黄绿色。 

  Tips:如果片段长度小于15KB,不需要脱嘌呤。可将浓HCl 直接稀释40 倍使用。脱嘌呤完毕后用蒸馏水将胶洗洗,后续操作也一样,换溶液之前可先用蒸馏水洗一次。 

  6.碱变性:Denaturization Buffer,摇30~45min(或15min X 2) 

  7.中和:Neutralization buffer,摇30~45min。 

  8.10×SSC转膜18~24hr。 

  Tips:转膜之前先将膜,滤纸裁好,并用10 X SSC浸泡,胶也用10 X SSC浸泡直至转膜。如果膜在浸泡数分钟后仍然不能完全浸湿,必须更换一张新膜,因为将DNA 转移到一张未均匀浸湿的膜上是不可靠的。在整个液体通路中,不能有气泡。 

  9.转膜结束后用铅笔给加样孔和DNA Marker 做标记。 

  10.2×SSC洗膜,室温干燥。 

  11.5000微焦耳/cm2紫外交联。 

  Tips:将UV 交联仪设定在1250。紫外照射的目的在于使DNA 中的一小部分T 与膜表面带正电的氨基基团之间形成交联(Church and Gilbert 1984)。紫外照射不能过度,否则将造成碱基T之间发生共价结合而降低杂交信号。交联时将膜上带有DNA的一面朝向紫外光源。 

  12.80℃烤干半小时。夹在两层滤纸间室温保存。 

  杂交: 

  1. 准备探针(PCR或随机引物标记,严格按照试剂盒的说明书操作) 。 

  2.预杂交:加入(预)杂交液,65℃ 60min。 

  3.杂交:换入新的杂交液。探针100℃变性5min 冰上2min,短暂离心后加入20ul到杂交管。65℃杂交过夜。 

  Tips:在操作同位素时,使用带滤芯的吸头,并小心操作,以防止枪污染同位素。 

  4.洗膜:2 X SSPE, 1mM EDTA, 0.2% SDS,65℃,15min X 2 次。 

  5. 洗膜:0.2 X SSPE, 1mM EDTA, 0.2% SDS ,65℃,15min X 2 次。 

  Tips:在洗膜的过程中,每洗一次需要用Mini Counter监测放射强度,当洗至10-20时,停止洗膜。 

  6. 压X 光片,-80?C 72 hrs 

  7. 洗片