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细菌转化—热激发
发布时间:2019-01-20 12:00:00来源:深圳市第二人民医院 分享:

  一、原理 

  质粒DNA粘附在细菌细胞表面,经过42°C短时间的热击处理,促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代,待质粒上所带的抗菌素基因表达,就可以在含抗菌素的培养基中生长。 

  二、器材 

  旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5ml 微量离心管,双面微量离心管架,干式恒温气浴(或恒温水浴锅),制冰机,恒温摇床,培养皿(已铺好固体LB-Amp),超净工作台,酒精灯,玻璃涂棒,恒温培养箱。 

  三、试剂 

  培养基(不加抗菌素),LB培养基(加抗菌素),无菌ddH2O,IPTG,X-gal. 

  四、实验准备 

  无菌ddH2O,1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌),20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配)。 

  五、操作步骤 

  (1)事先将恒温水浴的温度调到42℃。 

  (2)从-70℃ 超低温冰柜中取出一管(100μl)感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰上,冰浴5~10min。 

  (3) 加入5μl连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100ng),轻轻震荡后放置冰上20min。 

  (4) 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克,然后迅速放回冰中,静置3~5min。 

  (5) 在超净工作台中向上述各管中分别加入500μl LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h. 

  (6) 在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl,分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(注意:玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂)。 

  (7) 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话,滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal,8μl 20% IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。 

  (8) 在涂好的培养皿上做上标记,先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。 

  (9) 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面,写实验报告。 

  (10)观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑