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凝胶迁移或电泳迁移率实验EMSA
发布时间:2019-01-20 12:00:00来源:深圳市第二人民医院 分享:

  凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 

  原理:蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合,电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢,即表现为相对滞后(如下图所示)。该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白,并可通过加入特异性的抗体(supershift)来检测特定的蛋白质,并可进行未知蛋白的鉴定。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。 

  

  1.探针的标记: 

  (1) 如下设置探针标记的反应体系: 

  


  待标记探针 (1.75pmol/微升)         2微升 

  T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X)    1微升 

  Nuclease-Free Water             5微升 

  [γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml)      1微升 

  T4 Polynucleotide Kinase (5-10U/微升)    1微升 

  总体积 10微升 

  


  按照上述反应体系依次加入各种试剂,加入同位素后,Vortex混匀,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混匀。 

  (2) 使用水浴或PCR仪,37℃反应10分钟。 

  (3) 加入1微升探针标记终止液,混匀,终止探针标记反应。 

  (4) 再加入89微升TE,混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上,即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见,通常不必测定探针的标记效率。 

  (5) 标记好的探针最好立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。 

  2.探针的纯化: 

  通常为实验简便起见,可以不必纯化标记好的探针。在有些时候,纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化,可以按照如 下步骤操作: 

  (1) 对于100微升标记好的探针,加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵,再加入2体积即200微升的无水乙醇,混匀。 

  (2) 在-70℃至-80℃沉淀1小时,或在-20℃沉淀过夜。 

  (3) 在4℃,12000g-16000g离心30分钟。小心去除上清,切不可触及沉。 

  (4) 在4℃,12000g-16000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀,但不宜过分干燥。 

  (5) 加入100微升TE,完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存于-20℃。 

  3.EMSA胶的配制: 

  (1) 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具,或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具,以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果,可以选择可灌制较大EMSA 胶的模具。 

  (2) 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意:使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。 

  


  TBE buffer (10X)              1毫升 

  双蒸水     16.2毫升 

  39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)   2毫升 

  80% 甘油 625微升 

  10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate)     150微升 

  TEMED     10微升 

  


  (3) 按照上述次序加入各个溶液,加入TEMED前先混匀,加入TEMED后立即混匀,并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡, 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡,可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。 

  4.EMSA结合反应: 

  (1) 如下设置EMSA结合反应: 

  


  阴性对照反应: 

  Nuclease-Free Water              7微升 

  EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)          2微升 

  细胞核蛋白或纯化的转录因子            0微升 

  标记好的探针                   1微升 

  总体积           10微升 

  样品反应: 

  Nuclease-Free Water               5微升 

  EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)          2微升 

  细胞核蛋白或纯化的转录因子            2微升 

  标记好的探针                   1微升 

  总体积                     10微升 

  探针冷竞争反应: 

  Nuclease-Free Water               4微升 

  EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)         2微升 

  细胞核蛋白或纯化的转录因子            2微升 

  未标记的探针                   1微升 

  标记好的探针                   1微升 

  总体积                     10微升 

  突变探针的冷竞争反应: 

  Nuclease-Free Water               4微升 

  EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)         2微升 

  细胞核蛋白或纯化的转录因子            2微升 

  未标记的突变探针                 1微升 

  标记好的探针                   1微升 

  总体积                     10微升 

  Super-shift反应: 

  Nuclease-Free Water               4微升 

  EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)         2微升 

  细胞核蛋白或纯化的转录因子            2微升 

  目的蛋白特异抗体                 1微升 

  标记好的探针                   1微升 

  总体积                     10微升 

  


  (2) 按照上述顺序依次加入各种试剂,在加入标记好的探针前先混匀,并且室温(20-25℃)放置10分钟,从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合,或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针,混匀,室温(20-25℃)放置20分钟。 

  (3) 加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色,10X),混匀后立即上样。注意:有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合,建 议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样,可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液,至能观察到蓝颜色即可。 

  5. 电泳分析: 

  (1) 用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔,可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色),以观察电压是否正常进行。 

  (2) 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色),用于观察电泳进行的情况。 

  (3) 按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃,如果温度升高,需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处,停止电泳。 

  (4) 剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板,用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边 缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注:通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板),把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶,轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟),轻轻揭起滤纸,这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下,放平,在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜,确保保鲜膜和胶之间没有气泡。 

  (5)干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测,或用其它适当仪器设备检测。